В Великом княжестве Литовском и Польском королевстве полоцкая катастрофа вызвала всеобщее смятение. Сразу после получения известий о взятии города вальный сейм в Петрокове прекратил свою работу. Великий князь Литовский Сигизмунд II Август немедля сообщил Н.Я. Радзивиллу о своем возвращении в ВКЛ для организации обороны и приказал не вступать в прямой бой с московскими войсками (что, впрочем, было и так невозможно сделать при наличных силах), а предпринять все меры для защиты Вильни. Кроме того, надо признать, что падение Полоцка, безусловно, стало одной из важнейших причин заключения Люблинской унии 1569 года. Следствием этих событий был и привилей Сигизмунда Августа от 7 июня 1563 года, в котором он подтверждал равенство прав бояр православного и католического вероисповедания, несмотря на то что такое равенство было подтверждено еще в 1430 году.
Одновременно взятие Полоцка следует рассматривать как крупнейший политический и стратегический успех Ивана Грозного. «Если бы Иван IV умер… в момент своих величайших успехов на Западном фронте, своего приготовления к окончательному завоеванию Ливонии, историческая память присвоила бы ему имя великого завоевателя, создателя крупнейшей в мире державы, подобно Александру Македонскому», — писал историк Р. Виппер. Однако после Полоцка московское войско постигла череда военных неудач.
Посланник ВКЛ прибыл в Москву для проведения переговоров о соглашении в мае 1563 года, а посланник царя был принят королем в августе. Царь жаловался, что литвины напали на Северскую землю. 5 декабря на переговоры в Москву прибыло еще и королевское посольство в составе Юрия Андреевича Ходкевича, Григория Воловича и Михаила Харабурды. Переговоры продолжались до 9 января 1564 года, но оказались безрезультатными. Теперь царь требовал не только Ливонию и Полоцк, но и всю свою «вотчину» — все русские области в Великом княжестве Литовском, а также Львов и Галич. Как всегда, послы ВКЛ представили царю встречные требования — вернуть Литве ее прежние владения, включая Новгород, Псков, Чернигов, Смоленск, Полоцк и ряд других городов. Война возобновилась, но на сей раз успех сопутствовал литовско-русским силам.
Московские воеводы начали новое наступление в январе 1564 года. Армия Петра Шуйского (20 тыс. чел.) двинулась из Полоцка на Оршу на соединение с войсками князя Серебряного, шедшими из Вязьмы. Однако прежние победы, похоже, вскружили голову московским воеводам — в походе Шуйский не предпринял необходимых мер предосторожности. Не велась разведка, люди шли нестройными толпами без оружия и доспехов, которые везли на санях, так как никто не думал о нападении литвинов. Между тем армия ВКЛ во главе с Николаем Радзивиллом Рудым была наготове. Получив от лазутчиков точные данные о составе и направлении движения московских войск, Радзивилл со своим корпусом подстерег колонну Шуйского в лесистой местности близ реки Уллы (недалеко от Чашников) и неожиданно атаковал ее 26 января 1564 года сравнительно небольшими силами (4 тыс. чел.). Не успев принять боевой порядок и толком вооружиться, московские воины запаниковали и начали спасаться бегством, бросив весь обоз (5 тыс. телег), а Шуйский заплатил за беспечность собственной жизнью. Знаменитый покоритель Дерпта погиб в самом начале избиения своих войск, но его останки были доставлены в Вильню и погребены там с большой торжественностью, что вызвало негодование поляков при дворе Сигизмунда Августа.
Узнав о разгроме войск Шуйского, князь Серебряный отступил от Орши к Смоленску. А 30 апреля 1564 года из Юрьева перебежал на сторону ВКЛ крупный русский военачальник, близкий друг юных лет Ивана Грозного — князь Андрей Михайлович Курбский, что стало еще одним большим психологическим ударом для Москвы. Андрей Курбский происходил из династии Рюриковичей и был одним из самых талантливых московских полководцев, а до 1560 года еще и ближайшим советником царя. Но из-за разрыва Ивана Грозного с Избранной радой, а также небеспочвенно опасаясь царской немилости, он решил использовать традиционное для русских бояр право свободно служить любому князю по выбору. И в этом Курбский тогда был не одинок.
Следующая неудача постигла московские войска в сражении у городка-замка Озерище (ныне Езерище) в 60 км севернее Витебска, который осаждал 13-тысячный отряд воеводы Токмакова. На помощь осажденному гарнизону Озерищ из Витебска двинулся литовско-русский отряд во главе с воеводой Пацем (12 тыс. чел.). Сражение состоялось 22 июля 1564 года. Токмаков рассчитывал легко расправиться с литвинами, поэтому встретил их одной своей конницей. Она смяла авангард Паца, но не выдержала удара подошедших к полю боя основных сил литвинов и в беспорядке отступила, потеряв (по литовским данным) 5 тысяч человек. После поражения на Улле и под Озерищами московский натиск на ВКЛ был приостановлен почти на сто лет.
Андрей Курбский бежал в Литву не один, а во главе нескольких сотен подданных. Он был хорошо принят Сигизмундом Августом, поскольку мог дать ценные советы о том, как лучше воевать с Москвой. Курбский выразил желание лично принять участие в этой войне и набрать 200 всадников из своих последователей, за что Сигизмунд Август заплатил ему 200 тысяч грошей и назначил Курбского одним из трех командиров авангарда армии ВКЛ в осенней полоцкой кампании 1564 года под командованием Николая Радзивилла Рудого. В свою очередь Полоцк успешно защищал прежний соратник Курбского, князь Петр Михайлович Щенятев, бывший литвином по происхождению. Так что по иронии судьбы Гедиминович защищал Московию, а Рюрикович служил Литве.