Согласно его указу Московское царство делилось на две части: «Государеву светлость опричнину» и земство. В опричнину попали преимущественно северо-восточные земли Московии, где было мало бояр-вотчинников, ради ликвидации которых этот институт, собственно, и вводился. Центром опричнины стала Александровская слобода. А ее первыми жертвами — главный воевода в Казанском походе А.Б. Горбатый-Шуйский с сыном Петром, его шурин Пётр Ховрин, окольничий П. Головин (чей род традиционно занимал должности московских казначеев), П.И. Горенский-Оболенский (его младший брат Юрий успел спастись в Литве), князь Дмитрий Шевырёв, С. Лобан-Ростовский и др.
Началом образования опричного войска тоже считается 1565 год, когда был сформирован отряд в 1000 человек, отобранных из опричных уездов. Каждый опричник приносил клятву на верность царю и обязывался не общаться с земскими людьми. В дальнейшем число опричников достигло 6000 человек. В опричное войско включались также отряды стрельцов с опричных территорий. С этого времени служилые люди стали делиться на две категории: дети боярские, из земщины, и дети боярские, «дворовые и городовые», то есть получавшие государево жалованье непосредственно с «царского двора». Следовательно, опричным войском надо считать не только государев полк, но и служилых людей, набранных с опричных территорий и служивших под начальством опричных («дворовых») воевод и голов. Введение опричнины ознаменовалось массовыми репрессиями: казнями, конфискациями, опалами. С помощью опричников, которые были освобождены от судебной ответственности, Иоанн IV насильственно конфисковывал боярские и княжеские вотчины, передавая их дворянам-опричникам. Самим боярам и князьям предоставлялись поместья в других областях страны, например в Поволжье, причем далеко не всем. Напротив Кремля на Неглинной (территория нынешней РГБ) был построен каменный Опричный двор, куда переселился из Кремля царь.
В начале сентября 1567 года Грозный вызвал к себе английского посланника Дженкинсона и через него передал королеве Елизавете I просьбу о предоставлении убежища в Англии. Это было связано с известием о заговоре в земщине против него. По этому делу последовал ряд казней, а конюший боярин Иван Фёдоров-Челяднин, крайне популярный в народе своей неподкупностью и судейской добросовестностью, был сослан в Коломну. Вскоре его обвинили в том, что с помощью слуг он якобы собирался свергнуть царя. Фёдоров-Челяднин и еще 30 человек, признанные его сообщниками, были казнены, их поместья разгромлены, а все слуги перебиты. В целом, однако, репрессии носили беспорядочный характер. Хватали без разбора друзей и знакомых Челяднина, уцелевших сторонников Адашева, родню находившихся в эмиграции дворян и т. д. Побивали всех, кто осмеливался протестовать против опричнины. В подавляющем большинстве случаев казнили даже без видимости суда, по доносам и оговорам под пыткой. Как утверждают, Федорову-Челядину, например, царь собственноручно нанес удар ножом, после чего его изрезали опричники. В 1569 году Грозный покончил со своим двоюродным братом князем Владимиром Андреевичем Старицким: он был обвинен в намерении отравить царя и казнен вместе со своими слугами, а его мать Ефросинию Старицкую утопили вместе с 12 монахинями в реке Шексне.
Московский застенок XVI в.
Аллегория тирании Ивана IV.
Считая новгородскую знать участниками «заговора» князя Старицкого и подозревая ее в намерении переметнуться в Литву, в декабре того же 1569 года Иван IV двинул опричное войско против Новгорода. По дороге опричники устроили массовые убийства и грабежи в Твери, Клину, Торжке и других встречных городах. Было убито 1505 человек, в основном сидевшие по темницам литовские и татарские пленники, а также выселенные из своих домов псковичи и новгородцы, застигнутые опричниками по дороге в Москву. В Тверском Отрочьем монастыре в декабре 1569 года Малюта Скуратов лично задушил митрополита Филиппа, отказавшегося благословить царский поход на Новгород.
В самом Новгороде с применением различных пыток казнили множество горожан, включая женщин и детей. Точный подсчет жертв велся лишь на первых порах, когда Иван Грозный целенаправленно уничтожал новгородскую знать и приказных, устроив суд в Рюриковом городище (было убито 211 помещиков и 137 членов их семей, 45 дьяков и приказных, столько же членов их семей). В том числе главные дьяки Новгорода К. Румянцев и А. Бессонов, боярин В.Д. Данилов, заведовавший пушечными делами, виднейший боярин Фёдор Сырков, принимавший участие в составлении «Великих Четьих миней» и построивший на свои средства несколько церквей (его сначала окунули в ледяную воду Волхова, а затем живьем сварили в котле). После этого царь начал объезжать новгородские монастыри, отбирая у них все богатства, а опричники напали на Новгородский посад (остававшийся до тех пор нетронутым), перебив неведомое количество людей. С храма Св. Софии были сняты Васильевские ворота и перевезены в Александровскую слободу.
Расправившись с Новгородом, царь выступил на Псков. Его слуги убили игумена Псково-Печерского монастыря Корнилия, старца Вассиана Муромцева (с которым прежде переписывался А. Курбский), двух городовых приказчиков, одного подьячего и 30–40 детей боярских. После похода начался «розыск» о новгородской измене, проводившийся на протяжении всего 1570 года, причем к делу были привлечены и многие видные опричники. От этого дела сохранилось только описание в Переписной книге Посольского приказа: «Столп, а в нем статейный список из сыскного из изменного дела 1570 году на Новгородского Епископа Пимена и на новгородских дьяков и на подьячих, как они с (московскими) бояры… хотели Новгород и Псков отдати Литовскому королю… а царя Ивана Васильевича… хотели злым умышлением извести и на государство посадити князя Володимера Ондреевича… в том деле с пыток многие про ту измену на новгородцкого архиепископа Пимена и на его советников и на себя говорили, и в том деле многие кажнены смертью, розными казнми, и иные разосланы по тюрмам… Да туто ж список, ково казнити смертью, и какою казнью, и ково отпустити…».